Flag-Nanoab-Magnetic Beads

貨號：FNM-25-1000

儲存條件：可在4℃保存1年(確保*密封)，避免離心，干燥和凍融。

產(chǎn)品描述

偶聯(lián)anti-Flag-tag納米抗體的磁性納米微球用于免疫沉淀Flag-tag融合蛋白。

產(chǎn)品優(yōu)勢

l 沒有普通抗體的輕鏈和重鏈，背景干凈；

l 即用型，節(jié)約時間；

l 高親和力，高載量。

應用范圍

可用于免疫沉淀（IP）/免疫共沉淀（CoIP）、染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）/RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）、酶活性測定、質(zhì)譜分析等。

特異性

特異性結(jié)合位于融合蛋白N-端、C-端及內(nèi)部的Flag-tag。

產(chǎn)品特性

存儲緩沖液：PBS(含有20%乙醇)。

保存條件：可在4℃保存1年(確保*密封)，避免離心，干燥和凍融。

實驗步驟：

收集細胞
   每個免疫沉淀反應大約使用 10⁶-10⁷ 個表達Flag-tag融合蛋白的細胞，可根據(jù)Flag-tag融合蛋白表達量適當調(diào)整細胞數(shù)。吸出培養(yǎng)基，向培養(yǎng)皿中加入預冷的1×PBS，漂洗2次，利用細胞刮或胰酶消化收集貼壁細胞，細胞轉(zhuǎn)移到離心管，500g離心3分鐘并丟棄上清液。

植物組織裂解處理：

   取適量植物組織樣本（葉片等）放置于冷凍液氮中，之后將冷凍后得植物組織樣本放于研缽進行研磨，盡可能充分研磨破壞其細胞壁。加入500-1000ul RIPA 裂解液（已加蛋白酶抑制劑 PMSF 等）進行裂解，為了提高裂解效率，加入 200ul 玻璃粉充分震蕩 30min，裂解完成后 12000 rpm，離心 30min，吸取上清 置新的離心管中，棄去沉淀。

細胞裂解
1．在裂解緩沖液中加入蛋白酶抑制劑，用500μl預冷的裂解緩沖液重懸細胞。

2．置于冰上30分鐘，可每10分鐘充分吹打一次。
3．4℃，20,000g離心15分鐘，將裂解產(chǎn)物（上清）轉(zhuǎn)移到一個新的預冷管中，丟棄沉淀。注意：此時細胞裂解產(chǎn)物可長期保存于-80℃。

結(jié)合蛋白
4．將平衡好的Flag-Nanoab-Magnetic Beads加入到細胞裂解產(chǎn)物中（可在細胞裂解產(chǎn)物中直接加入40μl該產(chǎn)品），于4℃旋轉(zhuǎn)混合結(jié)合1小時。根據(jù)實驗需要可調(diào)整結(jié)合時間。如果需要，留存50μl的裂解產(chǎn)物進行免疫印跡分析。
5．在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態(tài)，丟棄上清液。如果需要，留存50μl上清液進行免疫印跡分析。

清洗珠子

6．用500μl預冷的裂解緩沖液中重懸5中的Flag-Nanoab-Magnetic Beads，在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態(tài)，丟棄上清液并重復清洗3次。盡量減少清洗時間。

洗脫蛋白
方法一：
7．加入20μl 2×SDS-sample buffer重懸Flag-Nanoab-Magnetic Beads。95℃，加熱10min充分變性，在磁力架上進行分離，收集的產(chǎn)物可進行SDS-PAGE及免疫印跡分析。
方法二：
8．加入50μl 0.2 M pH2.5的甘氨酸洗脫結(jié)合的蛋白，孵育時間30秒，期間不斷混勻，在磁力架上進行分離并收集上清，立即加入5μl 1.0 M Tris（pH10.4）以中和酸性的甘氨酸。

注意：為了提高洗脫效率可以重復這一步。

方法三：

9. 加入40µM Flag-peptide進行洗脫。

可選實驗方案
方案一：
如需進行Flag融合酶的活性檢測，無需洗脫，可以直接檢測。
方案二：
如需進行染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗，主要用于含有Flag融合蛋白的蛋白質(zhì)/DNA相互作用的實驗。染色質(zhì)免疫沉淀一般包括細胞固定，染色質(zhì)斷裂，染色質(zhì)免疫沉淀，聯(lián)反應的逆轉(zhuǎn)，DNA的純化以及DNA的鑒定。其中前期細胞固定，染色質(zhì)斷裂不變；然后接著直接進入說明書的第4步，加入細胞裂解產(chǎn)物后，DNA-蛋白質(zhì)復合物結(jié)合到Flag-Nanoab-Magnetic Beads上；
進入第5和6步，分離得到復合物；進入第8步，得到洗脫的復合物；后期交聯(lián)反應的逆轉(zhuǎn)，DNA的純化及DNA的鑒定等同于普通的ChIP實驗。RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）實驗步驟同上。
方案三：
Flag-Nanoab-Magnetic Beads不僅可以用于在體內(nèi)外檢測和驗證蛋白質(zhì)之間的相互作用，也可以結(jié)合質(zhì)譜分析篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白。其操作步驟同免疫沉淀法，得到洗脫的復合物后，然后進行SDS–PAGE分析，用考馬斯亮藍或者銀染的方法染色后，切下未知蛋白的條帶，用質(zhì)譜技術(shù)鑒定未知蛋白。