LabpO T A/Blunt平末端快速連接試劑盒（不含MSC）

產(chǎn)品貨號(hào)：PB0201

儲(chǔ)存溫度：－20℃儲(chǔ)存，6個(gè)月內(nèi)不影響使用效果。

產(chǎn)品介紹：

零背景平末端快速連接試劑盒是一種先進(jìn)的自sha基因陽(yáng)性選擇克隆系統(tǒng)，可以高效克隆平末端PCR產(chǎn)物和任何具有平末端的DNA片段。該試劑盒對(duì)磷酸化或非磷酸化的dna片段都有效.陽(yáng)性選擇載體和插入片段連接僅需5分鐘即可獲得超過(guò)90%的陽(yáng)性重組克隆。由具有校正活性的聚合酶(如: Pfu polymerase)擴(kuò)增的平末端PCR產(chǎn)物可直接連入克隆載體。連接產(chǎn)物可直接轉(zhuǎn)化常用的大腸桿菌菌株。

試劑盒提供- - 個(gè)新穎的自sha基因陽(yáng)性選擇克隆載體LabpO-Blunt Simple.該載體含有致死的自sha基因，當(dāng)載體與片段連接成功，自sha基因無(wú)法正確表達(dá)，包含重組子的細(xì)胞可以正常生長(zhǎng):當(dāng)載體與片段連接不成功，載體自連后自sha基因正確表達(dá)，包含自連空載體的細(xì)胞無(wú)法存活，即零背景.這種陽(yáng)性篩選策略無(wú)需藍(lán)白斑篩選，極大地加速了克隆篩選進(jìn)程.

LabpO-Blunt Simple消除了插入位點(diǎn)附近的多克隆酶切位點(diǎn)，需要在PCR擴(kuò)增引物上導(dǎo)入合適的酶切位點(diǎn)。此時(shí)如果使用PCR擴(kuò)增引物導(dǎo)入的酶切位點(diǎn)進(jìn)行DNA酶切時(shí)，酶切反應(yīng)將不會(huì)受到T載體上其它多克隆酶切位點(diǎn)上的限制酶影響，可以大大提高酶切效率，增加亞克隆成功率。

操作步驟：

1.連接反應(yīng)的準(zhǔn)備：

平末端PCR產(chǎn)物或者酶切后平末端片段可以通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離回收(使用長(zhǎng)波紫外光下切膠或者可見(jiàn)光透射切膠避免DNA損傷造成連接失敗)。與載體的摩爾比是3:1。 本公司生產(chǎn)的DNA產(chǎn)物快速純化回收試劑盒對(duì)70bp以上的DNA片段能很好地進(jìn)行回收。

2.連接反應(yīng)：

1)在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的10 μl連接反應(yīng)體系中，加入1 μl 40ng pZERO-Blunt Simple載體、X μl PCR產(chǎn)物(在通常狀況下，沒(méi)有必要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行精確定量，-般PCR產(chǎn)物與載體的摩爾比優(yōu)化至1:1~10:1 就可以得到良好結(jié)果，推薦3:1,見(jiàn)附錄)、5ul 2 x Quick ligation Buffer和0.9ul的T4 DNA Ligase，其余用滅菌水補(bǔ)足。

反應(yīng)按照以下體系進(jìn)行

一般最后加入T4 DNA Ligase。

2)22℃連接5-10min。

通常推薦22C連接5-10分鐘,，>3kb長(zhǎng)片段連接可以延長(zhǎng)至30分鐘。不推薦超過(guò)30分鐘,超過(guò)可能降低轉(zhuǎn)化子數(shù)量。

3)冰上冷卻，然后轉(zhuǎn)化或者儲(chǔ)存于-20℃。

3.轉(zhuǎn)化：

1)100ul感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速放入冰浴中，解凍融化（約1-3min左右）。

2)加入4-5ul連接液(最多可全部加入，只要體積不超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的1/10)， 用手撥da離心管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰浴放置30min。

3)42℃水浴熱激90秒，冰浴靜置2-3min，該過(guò)程不要搖動(dòng)離心管。

4）加500ul LB或者SOC培養(yǎng)基(不含抗生素)，37°C 150 rpm振蕩培養(yǎng)60分鐘。

5) 將200ul細(xì)菌涂布在氨芐青mei素(100μg/ml)平板上。

涂布細(xì)菌的用量依連接的效率及感受態(tài)細(xì)胞的感受率而進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，如果預(yù)計(jì)的克隆較少，可通過(guò)離心(4,000rpm, 2分鐘)后吸除部分培養(yǎng)液，留下適量的培養(yǎng)基懸浮菌體后取全部或者適量涂布于-個(gè)平板中(涂布剩余的菌液可以擱在4度保存，第2天如果轉(zhuǎn)化菌落數(shù)量少，可將剩余菌液全部涂-個(gè)新培養(yǎng)板)。

6) 平板在37°C下正向放置1小時(shí)以吸收過(guò)多的液體，然后倒置培養(yǎng)過(guò)夜。

4.轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定：

1). 常規(guī)檢測(cè):將得到的菌落接種1-5ml LB (含有終濃度為100ug /ml 的氨芐青霉.素)培養(yǎng)基，37°C搖床振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，保存菌種后提取質(zhì)粒，應(yīng)用PCR或酶切方法鑒定插入片段是否正確。

2).快速檢測(cè):挑取菌落直接進(jìn)行PCR檢測(cè)(可參見(jiàn)分子克隆第3版本或者參考本公司CV05-通用T載體菌落PCR鑒定試劑盒說(shuō)明書(shū))。

3).測(cè)序鑒定: 使用試劑盒自帶引物或者T7啟動(dòng)子引物測(cè)序確定是否含有目的克隆。

附錄:

如何計(jì)算連接反應(yīng)中需要的PCR產(chǎn)物的量?

一般PCR產(chǎn)物與載體的摩爾比優(yōu)化至1:1~10:1 (推薦3:1)就可以得到良好結(jié)果，可采用以下公式:

[加入載體的量(ng) X插入片段大小(kb)六載體大小(kb) ]X插入片段和載體的摩爾比= =插入片段的量(ng)例如: 插入片段和載體連接的摩爾比例為3:1，如連接反應(yīng)中加入載體40ng，插入片段大小為500bp，這時(shí)應(yīng)加入插入片段的量為[40ng載體X0.5kb插入片段: 2.974kb載體]X 3/1=20.2ng.

LabpO-Blunt Simple載體圖譜：

LabpO-Blunt Simple 載體克隆位點(diǎn)序列：