Long Taq DNA Ploymerase

貨號：LT0201

儲存溫度：-20^。C，濃度5U/ul。

產(chǎn)品組成、濃度

產(chǎn)品介紹

一般PCR法具有一定的局限性，特別是難以擴增5kb以上的長鏈DNA，這嚴(yán)重限制了PCR法的推廣和應(yīng)用。通過改變PCR用DNA聚合酶、PCR用Buffer、PCR擴增條件等，使長鏈DNA的擴增成為可能，這就是LA（Long and Accurate）PCR技術(shù)。本試劑盒所用的Long Taq是Taq聚合酶和有矯正作用的聚合酶的混合物，這種聚合酶可以染色體和其他細胞器的DNA為模板高效進行PCR反應(yīng)。在人的染色體上可以擴增長度可達27kb的DNA片段，而以λDNA為模板則可擴增出高達40kb的片段。

適用范圍

一般用于DNA片段的PCR擴增、DNA標(biāo)記、引物延伸、序列測定、DNA平末端加A等，產(chǎn)物可直接用于TA克隆。

建議循環(huán)條件

*擴增大片段尤其是20kb以上的片段建議15-30個循環(huán)，每個循環(huán)的延伸時間要增加10-15sec“自動延伸"時間，如果PCR儀器沒有“自動延時"功能，那么設(shè)定延伸時間建議在原有基礎(chǔ)上增加1-4min。

注意事項：

1.10xLong Taq Buffer pH值較高，可能會形成【Mg(OH)2】沉淀，使用蒨要充分溶解，并用Votex保證可能的沉淀重新溶解，或者37^。C溫育5min，然后Votex充分混勻。

2. 擴增長片段建議使用0.2ul薄壁管。其他試管未經(jīng)測試。較厚的試管在92^。C時不能有效的使模板變性。變性時，盡可能縮短變性時間，降低變性溫度。第一步變性在92^。C-94^。C下進行2min（GC含量高可能延長時間達5min）。再循環(huán)過程中盡可能縮短變性時間（92^。C-94^。C下進行10-15s），除非模板中富含GC，則95^。C下變性30s，這可以防止DNA脫嘌呤和鏈斷裂，對于所需擴增的基因組DNA片段中長度超過12kb時，應(yīng)盡可能降低變性溫度和時間。變性需要的時間在不同PCR儀上稍有不同。

3. 如果擴增片段GC含量高或者擴增片段比較長，可在反應(yīng)混合物中加入DMSO到終濃度1%-8%，zui常用2%（小于30kb）或者4%（大于30kb）往往會改善擴增效果。

4. 擴增長片段，引物一般終濃度為0.3-1uM，長度最好為27-36bp；退火溫度一般在65^。C-70^。C，此時退火溫度和延伸溫度基本一致，可將退火延伸在一個溫度進行，使用2階段擴增法。當(dāng)然如果設(shè)計的引物在20bp左右，則還是使用傳統(tǒng)3階段擴增法。

5. 模板一般使用0.01-2.5ng(λ phage)或者0.1-1ug（human）。

6. 1xLong Taq buffer中Mg2+濃度為2.5mM，建議dNTP濃度為400mM，要得到最佳結(jié)果，優(yōu)化Mg2+是必須的。如果含有較高的EDTA或螯合劑，則應(yīng)該提高Mg2+；如果要增加dNTP濃度，相應(yīng)的也要增加Mg2+濃度。